door Stephanie Seneff
Een paper werd onlangs gepubliceerd door Antoniou et al. met de vetgedrukte titel: "Glyfosaat vervangt geen glycine in eiwitten van actief delende zoogdiercellen." [1]. Het artikel omvatte het zes dagen blootstellen van menselijke borstkankercellen aan glyfosaat en vervolgens het gebruik van een geavanceerde techniek genaamd Tandem Mass Tag (TMT) labeling om korte peptiden te identificeren die zogenaamd abnormaal zware glycinemoleculen bevatten. Eiwitten van zowel de behandelde als onbehandelde cellen werden onderworpen aan een standaardprotocol met massaspectrometrie, gedeeltelijke proteolyse en verdere analyse, zoals beschreven in het papier.
De cellen werden gehouden op een rijke voedingsformulering genaamd Dulbecco's Modified Eagle Medium. Deze formulering is een wijziging van de originele Basal Medium Eagle die viervoudig is verrijkt met aminozuren en vitamines. Het heeft ook een hoge glucoseconcentratie van 4500 mg/L. Er is geen garantie dat het niet besmet is met glyfosaat. Bovendien waren de cellen in het verleden enige tijd in cultuur gekweekt en hadden ze waarschijnlijk aanzienlijke aantallen verkeerd gevouwen met glyfosaat besmette eiwitten verzameld die moeilijk te verwijderen waren. Waarschijnlijk begonnen ze hun leven al in kweek met met glyfosaat besmette eiwitten, door levenslange blootstelling aan glyfosaat van de mens die deze cellen oorspronkelijk in een borsttumor had ondergebracht.
De auteurs hebben de monsters getest op twee verschillende post-translationele modificaties (PTM's): glyoxylaat-gemodificeerd cysteïne en glyfosaatsubstitutie voor glycine. Ze omvatten de glyoxylaatmodificatie omdat ze veronderstelden dat glyfosaat zou kunnen worden afgebroken tot glyoxylaat, dat in staat is te binden aan cysteïneresiduen. Ze detecteerden met name geen met glyoxylaat gemodificeerde cysteïnes in de controlecellen of de behandelde cellen.
Daarentegen vonden de auteurs een substantieel signaal voor de aanwezigheid van glyfosaat in verschillende korte peptiden in de behandelde monsters. Ze vonden echter ook een even sterk signaal in de onbehandelde monsters. Ze schreven: "In dit experiment zou echter geen van de twee vermeende PTM's (post-translationele modificaties) van belang aanwezig zijn in afwezigheid van glyfosaatbehandeling. Het was dus mogelijk om TMT-labeling te gebruiken om eventuele potentiële valse ontdekkingen.'' En dan: "De gegevens tonen onomstotelijk aan dat alle kandidaat-gesubstitueerde peptiden valse ontdekkingen zijn."
Een even plausibel argument is echter dat de "onbehandelde" cellen ook glyfosaat-gesubstitueerde eiwitten herbergen. Potentieel zijn de meeste, zo niet alle kandidaat-gesubstitueerde peptiden echte ontdekkingen. Omdat zowel de behandelde als de controlecellen in het verleden lange tijd aan glyfosaat waren blootgesteld, is het aannemelijk dat ze beide met glyfosaat besmette eiwitten in bijna gelijke hoeveelheden hadden opgehoopt. Anthony Samsel en ik bespraken in ons eerste artikel over glyfosaatsubstitutie voor glycine bewijs dat N-gesubstitueerde glycines peptoïden kunnen vormen die erg moeilijk af te breken zijn, en dat is aangetoond dat fosfonaten een vermogen hebben om proteolyse te remmen [2].
Het idee dat blootstelling aan glyfosaat resulteert in de accumulatie van proteolyse-resistente eiwitten wordt ondersteund door een in 2013 gepubliceerde studie over erwtenplanten [3]. De auteurs observeerden een accumulatie van alomtegenwoordige eiwitten samen met opregulatie van proteolyse-enzymen, wat verrassend en ongebruikelijk is. Zij schreven:
"De accumulatie van alomtegenwoordige eiwitten, samen met een verhoogde vermeende proteasoomactiviteit, werd waargenomen via ABPP [Activity-based Protein Profiling], wat wijst op een rol voor het proteasoom bij herbicidebehandeling. Accumulatie van alomtegenwoordige eiwitten is doorgaans beschreven in verband met een gelijktijdige afname van proteasoomactiviteit Desalniettemin toonden onze resultaten toenames in zowel proteasoomsubstraatniveaus als activiteiten. Dus de herbicide-geïnduceerde stress op het proteoom zou kunnen resulteren in de accumulatie van alomtegenwoordige eiwitten, ondanks de verhoogde proteasoomactiviteit, of de verhoogde beschikbaarheid van het substraat zou kunnen proteasoomactiviteit induceren."
Een waarschijnlijke verklaring is dat glyfosaat ingebed in de eiwitten het vermogen van de proteolytische enzymen om het af te breken verstoort. In feite hebben we in een artikel dat glyfosaat koppelt aan amyotrofische laterale sclerose (ALS), beschreven hoe glyfosaat het ubiquitinatieproces zelf zou kunnen verstoren, dat eiwitten markeert voor verwijdering door het proteasoom [4]. We schreven:
"Het meest intrigerend is het feit dat ubiquitine zelf in hoge mate afhankelijk is van een sterk geconserveerd carboxy-terminaal dubbel-glycinepaar om de complexe ubiquitineketens te bouwen die een eiwit voor afbraak signaleren [46] [ hier weergegeven als [5] ]. Vervanging van glyfosaat voor beide van deze essentiële glycines zou naar verwachting het proces van het recyclen van verkeerd gevouwen eiwitten aantasten. Dit zou gemakkelijk de accumulatie van verkeerd gevouwen eiwitten kunnen verklaren, wat een kenmerkend kenmerk is van ALS."
Gelukkig voor ons, Antoniou et al. [1] gaf in hun Tabel 3 de exacte sequenties met glyfosaatsubstituties die werden gedetecteerd, en de Uniprot-website biedt een hulpmiddel waar men eiwitten kan vinden die specifieke sequenties bevatten, met behulp van een softwarepakket genaamd BLAST. Uniprot was in staat om de identiteit te achterhalen van alle 15 eiwitten die als treffers in hun figuur 3 werden geleverd, met een exacte overeenkomst met een sequentie die aanwezig is in elk eiwit. Alle 15 eiwitten waren menselijke eiwitten. Ten minste negen van deze eiwitten binden aan fosfaatbevattende moleculen, zoals opgesomd in Tabel 1. Dit ondersteunt het idee dat eiwitten die fosfaat binden bijzonder gevoelig zijn voor glyfosaatsubstitutie, zoals werd uiteengezet in een recent artikel gepubliceerd door Gunatilake et al. [6],stelt voor dat glyfosaat een belangrijke factor is bij chronische nierziekte van onbekende etiologie (CKDu) onder landarbeiders in Sri Lanka. In feite bevat het eiwit EPSP-synthase in planten waarvan wordt aangenomen dat het het belangrijkste doelwit is van glyfosaat bij het doden van onkruid, een sterk geconserveerd glycineresidu op de plaats waar fosfoenolpyruvaat (PEP) bindt. Onderzoekers van DowDupont hebben CRISPR-technologie kunnen gebruiken om een maïsstam te creëren die resistent is tegen glyfosaat, dankzij een CRISPR-gemodificeerd gen voor EPSP-synthase [7]. De eerste stap die ze deden was de DNA-code veranderen om de glycine op de PEP-bindingsplaats te vervangen door alanine. Dit resulteerde in een versie van het enzym die volledig ongevoelig was voor glyfosaat.het eiwit EPSP-synthase in planten waarvan wordt aangenomen dat het het belangrijkste doelwit is van glyfosaat bij het doden van onkruid, bevat een sterk geconserveerd glycineresidu op de plaats waar fosfoenolpyruvaat (PEP) bindt. Onderzoekers van DowDupont hebben CRISPR-technologie kunnen gebruiken om een maïsstam te creëren die resistent is tegen glyfosaat, dankzij een CRISPR-gemodificeerd gen voor EPSP-synthase [7]. De eerste stap die ze deden was de DNA-code veranderen om de glycine op de PEP-bindingsplaats te vervangen door alanine. Dit resulteerde in een versie van het enzym die volledig ongevoelig was voor glyfosaat.het eiwit EPSP-synthase in planten waarvan wordt aangenomen dat het het belangrijkste doelwit is van glyfosaat bij het doden van onkruid, bevat een sterk geconserveerd glycineresidu op de plaats waar fosfoenolpyruvaat (PEP) bindt. Onderzoekers van DowDupont hebben CRISPR-technologie kunnen gebruiken om een maïsstam te creëren die resistent is tegen glyfosaat, dankzij een CRISPR-gemodificeerd gen voor EPSP-synthase [7]. De eerste stap die ze deden was de DNA-code veranderen om de glycine op de PEP-bindingsplaats te vervangen door alanine. Dit resulteerde in een versie van het enzym die volledig ongevoelig was voor glyfosaat.Onderzoekers van DowDupont hebben CRISPR-technologie kunnen gebruiken om een maïsstam te creëren die resistent is tegen glyfosaat, dankzij een CRISPR-gemodificeerd gen voor EPSP-synthase [7]. De eerste stap die ze deden was de DNA-code veranderen om de glycine op de PEP-bindingsplaats te vervangen door alanine. Dit resulteerde in een versie van het enzym die volledig ongevoelig was voor glyfosaat.Onderzoekers van DowDupont hebben CRISPR-technologie kunnen gebruiken om een maïsstam te creëren die resistent is tegen glyfosaat, dankzij een CRISPR-gemodificeerd gen voor EPSP-synthase [7]. De eerste stap die ze deden was de DNA-code veranderen om de glycine op de PEP-bindingsplaats te vervangen door alanine. Dit resulteerde in een versie van het enzym die volledig ongevoelig was voor glyfosaat.
Tabel 1 : Negen eiwitten die glyfosaat-gesubstitueerde peptiden bevatten, zoals geïdentificeerd met behulp van Tandem Mass Tag (TMT) spectrometrie-instrumenten. Deze peptiden werden, samen met nog 6 andere, gevonden in kankercellen die in kweek waren gekweekt. Alle negen binden aan fosfaatbevattende moleculen zoals aangegeven in de derde kolom. De eerste kolom geeft de gedetecteerde sequentie weer, waarbij de "*" een glycineresidu aangeeft waarvan werd gevonden dat het gesubstitueerd was. Zie: Antoniou et al. (2019) voor details over de experimentele opstelling.
| Volgorde | Eiwit naam | Fosfaathoudend substraat |
| AIRQTSELTLG*K | Zinkvingerproteïne 624 | DNA |
| DG*QDRPLTKINSVK | Pleckstrin homologie domeinbevattende familie A-lid 5 | Fosfatidylinositolfosfaat |
| EPVASLEQEEQG*K | Dubbel homeobox-eiwit A | DNA |
| G*ELVMQYK | Diacylglycerolkinase-gamma | ATP |
| GKELSG*LG*SALK | Zeer lange-keten specifieke acyl-CoA dehydrogenase mitochondriaal | DIK |
| KDGLG*GDK | G-eiwit gekoppelde receptor 158 | GTP |
| NEKYLG*FGTPSNLGK | ATP-afhankelijke Clp-protease ATP-bindende subeenheid | ATP |
| RTVCAKSIFELWG*HGQSPEELYSSLK | tRNA (guanine(10)-N2) methyltransferase homoloog | tRNA |
| VTG*QLSVINSK | Eiwit O-mannosyl-transferase 2 (Q9UKY4) | dolichylfosfaat |
Al met al onthult Tabel 1 een intrigerende lijst van menselijke eiwitten, en veel van hen zouden naar verwachting tot expressie worden gebracht in borstkankercellen. Een daarvan is bijvoorbeeld een RNA-methylatie-eiwit (tRNA (guanine(10)-N2)-methyltransferase-homoloog). Een ander heeft een tumorsuppressorfunctie door middel van Akt-remming, door te binden aan fosfatidylinositolfosfaten (Pleckstrin homologiedomein-bevattende familie A-lid 5). Een andere is een G-proteïne gekoppelde receptor (GPCR). Volgens Bar-Shavit et al. "Controleren GPCR's vele kenmerken van tumorigenese, waaronder immuuncel-gemedieerde functies, proliferatie, invasie en overleving op de secundaire plaats." [8] Een andere hit is een homeobox-eiwit, en er wordt specifiek aangenomen dat deze klasse van eiwitten een oorzakelijke rol speelt bij borstkanker [9].
Een andere belangrijke ontdekking uit dit artikel zijn de twee eiwitten die werden geïdentificeerd als statistisch significant opgereguleerd als reactie op de zesdaagse glyfosaatbehandeling. Dit zijn: ADP/ATP nucleotide translocase (ANT) en serine/arginine-rijke splicing factor 6 (SRSF6) [1]. Deze twee eiwitten blijken erg interessant te zijn, omdat bekend is dat beide tot overexpressie worden gebracht in tumorcellen, en in beide gevallen zijn hogere niveaus van deze eiwitten gekoppeld aan een slechte uitkomst bij kankerpatiënten.
SRSF6 is een lid van de familie van splitsingsfactoren die krachtige mogelijkheden hebben om eiwitexpressie te veranderen, door te wijzigen hoe peptiden worden samengesteld uit individuele exons. Overexpressie van SRSF6 in longepitheelcellen versterkte de proliferatie, beschermde ze tegen chemotherapie en verhoogde hun vermogen om tumoren te vormen [10]. Bovendien verminderde de knockdown van SRSF6 in long- en colonkankercellijnen hun tumorigene potentieel. SRSF6 komt vaak tot expressie bij huidkanker en verandert de splitsing van een eiwit genaamd tenascine C om invasieve en uitgezaaide kanker te bevorderen [11]. SRSF6 veroorzaakt ook overmatige proliferatie van keratinocyten, een kenmerkend kenmerk van psoriasis [12]. Als glyfosaat ervoor zorgt dat SRSF6 wordt opgereguleerd in borstkankercellen, veroorzaakt dit waarschijnlijk verhoogde tumorigenese bij blootgestelde mensen.
ANT komt in verschillende isovormen met verschillende effecten op de celbiologie, maar degene die sterk tot expressie wordt gebracht in borstkankercellen is ANT2 en het is aangetoond dat het belangrijk is voor het behoud van de overleving van tumoren. Het is de taak van ANT2 om ATP naar de mitochondriën te transporteren, en deze activiteit is belangrijk wanneer een cel werkt onder de aannames van het Warburg-effect. Kankercellen produceren veel van hun ATP in het cytoplasma door middel van glycolyse, en vervolgens draagt ANT2 het ATP naar de mitochondriën, zodat ze de hoeveelheid ATP die ze moeten produceren door oxidatieve fosforylering kunnen verminderen. Dit is een goede strategie om te beschermen tegen oxidatieve schade, vooral wanneer mitochondriën mogelijk disfunctioneel zijn als gevolg van DNA-mutaties die zijn veroorzaakt door toxische blootstelling.ANT2 programmeert een cel in feite om strategieën te implementeren die leiden tot verhoogde proliferatie in plaats van apoptose (celdood) in de aanwezigheid van stressoren [13]. Er is recent interesse geweest in het ontwikkelen van medicijnen die kanker bestrijden door de ANT2-activiteit te onderdrukken [14].
De Antoniou et al. papier kan een belangrijke doorbraak zijn in onze zoektocht naar een procedure voor het detecteren van glyfosaatverontreiniging in eiwitten. Het is opmerkelijk dat ze 15 menselijke eiwitten konden identificeren die lijken te zijn gemodificeerd door glyfosaatsubstitutie voor een specifiek glycineresidu. Het document is van grote waarde voor de gemeenschap in het algemeen, omdat het een voorgeschreven procedure specificeert die nu vrij routinematig kan worden toegepast op meerdere andere celtypen die in kweek worden gekweekt, evenals op biologische monsters die zijn geëxtraheerd uit zieke weefsels bij zoogdieren, zoals vingernagels van sclerodermiepatiënten, huidcellen bij psoriasispatiënten, haarmonsters van autistische kinderen, hoeven van paarden die lijden aan grondlegger, tumorbiopten, postmortale plaque van Alzheimer, zieke nier- en leverweefsels, enz.
Toekomstige mogelijkheden om met glyfosaat besmette eiwitten te ontdekken zijn er in overvloed, en aangezien we een database met specifieke substitutiepatronen verzamelen, kunnen we misschien zelfs regels voorspellen voor peptidecontexten waar glycineresiduen bijzonder gevoelig zijn, zoals wanneer aangrenzende aminozuren klein zijn (om te voorkomen dat sterische hindering) of positief geladen (om glyfosaat aan te trekken naar de plaats van peptideassemblage vanwege zijn negatieve lading). Inderdaad, dit soort regels worden al duidelijk in de kleine verzameling die is gevonden in de Antoniou et al. experiment. Zes van de 15 beweerde gesubstitueerde glycines werden onmiddellijk gevolgd door een positief geladen aminozuur (lysine, histidine of arginine). En tien werden onmiddellijk voorafgegaan door een van valine, leucine, serine of threonine, allemaal kleine aminozuren die ruimte bieden voor glyfosaat's methylfosfonyl staart. Als glyfosaat inderdaad glycine vervangt tijdens de eiwitsynthese, zijn de gevolgen verbijsterend, en de verraderlijke cumulatieve toxische effecten van glyfosaat kunnen gemakkelijk de stijging verklaren die we vandaag zien in de prevalentie van een lange lijst van auto-immuun-, metabole, neurologische en oncologische ziekten.
Referenties
[1] MN Antoniou et al. Glyfosaat vervangt glycine niet in eiwitten van actief delende zoogdiercellen. BMC Res-opmerkingen 2019; 12:494. (Weblink)
[2] A Samsel en S Seneff. Glyfosaat, wegen naar moderne ziekten V: Aminozuuranaloog van glycine in diverse eiwitten. Tijdschrift voor biologische fysica en chemie 2016; 16: 9-46. (Weblink) (Download)
[3] Een Zulet et al. Proteolytische routes geïnduceerd door herbiciden die de aminozuurbiosynthese remmen. PLoS ONE 2013; 8 (9): e73847. (Weblink)
[4] S Seneff et al. Draagt glyfosaat als glycine-analoog bij aan ALS? J Bioinfo Proteomics Rev2016: 2 (3): 1-21. (Weblink) (Download)
[5] Een Zuin et al. Ubiquitine-signalering: extreem behoud als bron van diversiteit. Cellen 2014; 3(3): 690-701. (Weblink)
[6] S Gunatilake et al. De synergetische toxiciteit van glyfosaat in combinatie met andere factoren als oorzaak van chronische nierziekte van onbekende oorsprong. Int J Environ Res Volksgezondheid 2019; 16(15). pi: E2734. (Weblink) (Download)
[7] Y Dong et al. Desensibilisatie van EPSP-synthase van planten voor glyfosaat: Geoptimaliseerde globale sequentiecontext biedt plaats aan een glycine-naar-alanine-verandering in de actieve plaats. J Biol Chem 2019; 294(2): 716-725. (Web link)
[8] R Bar-Shavit et al. G-eiwitgekoppelde receptoren bij kanker. Int J Mol Sci 2016; 17(8). pi: E1320. (Weblink)
[9] MT Lewis. Homeobox-genen bij de ontwikkeling van de borstklier en neoplasie. Borstkankeronderzoek 2000; 2: 159. (Weblink)
[10] M Cohen-Eliav et al. De splitsingsfactor SRSF6 wordt geamplificeerd en is een oncoproteïne bij long- en darmkanker. J Pathol 2013; 229(4): 630-9. (Weblink)
[11] MA Jensen et al. Splicing factor SRSF6 bevordert hyperplasie van de overgevoelige huid. Nat Struct Mol Biol 2014; 21(2): 189197. (Weblink)
[12]H.Valdimarsson et al. Psoriasis: een ziekte van abnormale proliferatie van keratinocyten veroorzaakt door T-lymfocyten. Immunol Vandaag 1986; 7 (9): 256-9. (Weblink)
[13] SH Baik en J Lee. Adenine nucleotide translocase 2: een opkomende speler in kanker. J Stamcelonderzoek Med 2016; 1(2): 66-68. (Weblink)
[14] JY Jang et al. Onderdrukking van adenine-nucleotide translocase-2 door op vectoren gebaseerd siRNA in menselijke borstkankercellen induceert apoptose en remt tumorgroei in vitro en in vivo. Borstkankeronderzoek 2008; 10(1): R11. (Web link)
Comments
Post a Comment